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大腸桿菌測定新方法

 

發布日期:[2011/5/8 14:41:26]    來源:青島至成生物技術有限公司

 

    檢測原理:
    大腸菌群是一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌,該菌主要來源于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中的大腸菌群數系以100ml(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。
2.儀器設備與器具:
2.1 恒溫培養箱:36±1℃。
2.2 1000ml三角燒瓶、1ml、10ml移液管。
2.3 接種針。
2.4 顯微鏡。
2.5 超凈工作臺。
2.6 玻片、酒精燈、洗耳球、試管架。
2.7 天平:感量0.01g。
2.8 滅菌釜。
2.9 培養皿(直徑為90mm)、試管,經121℃、30分鐘滅菌。
2.10試管夾、酒精燈、秒表、載玻片 3.培養基及試劑:
3.1 乳糖膽鹽發酵管:按照制造廠家使用說明進行配制,滅菌。
3.2 伊紅美蘭瓊脂平板: 按照制造廠家使用說明進行配制,滅菌。
3.3 乳糖發酵管: 按照制造廠家使用說明進行配制,滅菌。
3.4 革蘭氏染色液。
3.4.1 結晶紫染色液:
結晶紫 1g
95%乙醇 20ml
1%草酸銨水溶液 80ml
將結晶紫溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
3.4.2 革蘭氏碘液:
碘 1g
碘化鉀 2g
蒸餾水 300ml
將碘與碘化鉀先進行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300 ml。
3.4.3 沙黃復染液:
沙黃 0.25g
95%乙醇 10ml
蒸餾水 90ml
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
3.5 生理鹽水。
4.檢驗程序:
檢樣

稀釋

乳糖膽鹽發酵管,36±1℃,24±2hr

↓ ↓
不產氣 產氣
↓ ↓
大腸菌群陰性 伊紅美蘭瓊脂平板,36±1℃,24±2hr

報告 ↓ ↓
革蘭氏染色 乳糖發酵管,36±1℃,24±2hr

↓ ↓ ↓ ↓
G+ G-,無芽孢桿菌 產氣 不產氣
↓ ↓
大腸菌群陰性 大腸菌群陰性
↓ ↓ ↓
報告 大腸菌群陽性 報告

5.測定方法:
5.1 檢樣稀釋:
5.1.1 以無菌操作將檢樣25ml(或25g)放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌塑料燒杯中,經充分振搖成1:10均勻稀釋液。
5.1.2 用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,注入含有9ml滅菌生理鹽水的 試管中,振搖成1:100稀釋液。
5.1.3 重復5.1.2的操作,使成1:1000稀釋液。
5.2乳糖膽鹽發酵試驗:根據食品衛生標準要求或對檢樣污染情況的估計,選擇二個稀釋度,每一稀釋度接種3管,接種量在1ml以上者,用雙料乳糖膽鹽發酵管。1ml及1ml以下者,用單料乳糖膽鹽發酵管。然后置于36±1 ℃培
養箱內,培養24±2hr,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣,則可報告為大腸菌
群陰性;如有產氣者,則可按以下程序進行。
5.3分離培養:將產氣的發酵管分別接種于伊紅美蘭瓊脂平板上,置36±1℃溫箱內,培養24hr后取出,觀察菌落形態,并作革蘭氏染色。
5.4證實試驗:在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色同時接種乳糖發酵管,置于36±1℃溫箱內培養24±2hr,觀察產氣情況。乳糖發酵管產氣,革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
5.5報告:根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100ml(g)大腸菌群的最可能數。
食品中金黃葡萄球菌的檢測方法
金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌,也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界,如空氣、土壤、水及其它環境中。在人類和動物的皮膚及外界相通的腔道中,也經常有本菌存在。據報導,在正常人群中的帶菌率可達30%~80%,其中皮膚帶菌率為8~22%,鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上,因此其可通過各種途徑和方式,尤其是經工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產生腸毒素,故一旦細菌污染食品,并在合適的溫度環境下,細菌可以大量繁殖并產生腸毒素,從而引起消費者食物中毒。
由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒,在世界各國都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區發病率更高。在上述這些國家中,每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例,僅次于沙門氏菌,而在細菌性食物中毒病例排到第2~3位,有此而造成的經濟損失也相當慘重,在我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時有報導,所以目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛生的法定檢測項目。
我國對金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標準GB.4789-10-84及檢驗檢疫系統行業標準SN.0172-92作為依據。整個檢測過程獲得最終結果須時5天左右,既費時又費力,并造成貨物積壓,也影響貨物的及時出運,并使貨主的倉儲成本提高,造成較大的經濟損失。
多年來很多食品微生物實驗室都在探索和尋找一些準確性高,并快速的檢測方法,最近我們分別從美國3M公司和法國生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測致病性金黃色葡萄球菌的培養基,其名稱為:
① Petrifilm RSA. Count Plate(由美國3M公司研制生產),是一種薄膜型快速檢測金黃色葡萄球菌的計數平板。
② Baird-parker + RPF Agar.(由法國生物梅里埃公司研制生產的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測計數平板)。
原理:Petrifilm. RSA. 測試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養基片,此培養基中含有經修正的Barid-Parker,營養成分加上以冷水可溶解的膠質。第二部分是一種耐熱核酸酶(TNase)反應片,含有DNA及甲苯胺蘭 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計數及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。
耐熱去氧核糖核酸(deoxyribonulcas Dnase)為產毒金葡菌之典型特征,此酶非常耐熱,在100℃加熱30min,不易喪失活性,在130℃之下,其D值為16.6min,此酶之分子量為16800,等電點PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測血漿凝固酶相似,是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法,在Petrifilm. RSA 檢測片上,耐熱DNA酶反應看起來,呈粉紅色環帶包圍著一個紅色或蘭色的菌落。
Petrifilm.RSA檢測片,必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應片一起使用,單獨使用將不會顯示菌落,因為具有輔助計數菌落的指示劑是在反應片上,而不是在Petrifilm.RSA檢測片上。
Baird-parker + RPF agar,這一培養基中含有豐富的營養成分,其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀,使菌落顏色呈黑色,RPF補充有兔血漿和牛纖維蛋白原,以便檢測凝固酶活力,胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍沉淀暈環纖維蛋白的溶解,因此凡存在血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌,將在培養基中呈現有暈環的黑色菌落,即可確認,并作計數。

實驗實施
材料和方法:
本次實驗采用以下3種試劑:
1. 美國3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate.
2. 法國生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar .
3. 實驗室自配Baird-Park瓊脂(英國Oxoid)及新鮮兔血漿。

菌種來自美國菌種保存中心(America TyP Culture Collection)。金黃色葡萄球菌共10株菌株,其菌號分別為:
ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704
ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213
ATCC 8095 ATCC 12598
非金黃色葡萄球菌菌種5株,其菌號分別為:
ATCC 51813 (大腸桿菌)、ATCC 624 (無乳鏈球菌)、ATCC 51816 (陰溝腸桿菌)、ATCC 6051 (枯草桿菌)、ATCC 49214 (腸炎沙門氏菌)、自然食品檢樣,任意購自市場。
本次實驗是以同一測試樣品經均質并通過無菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個稀釋度同時接種上述三種培養基作平行實驗,在取得最終結果后相互進行比對。
上述三種培養基的接種方法是按生產商所提供的使用說明進行操作,另外Baird-Parker Agar 培養基是按SN0172-92標準進行操作。
A、 本次實驗共測試已知標準菌種共15株,其中葡萄球菌10株,其他菌種5株(包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無乳鏈球菌)。
B、 測試自然食品檢樣共101只(其中包括肉11只、肉類14只、水產品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只)。

結果:
A、 被檢菌種10株,金黃色葡萄球菌在三種培養基上都能檢出生長情況良好,同一稀釋度的菌液,除個別菌株外在3種培養基計數檢測結果基本都在一個數量級上,無顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養基上全部不能生長。
B、 自然食品檢樣共接種101只,每一檢樣同一稀釋濃度分別同時種三種培養基,最終共檢出金黃色葡萄球菌45只,占全部檢樣的44.5%,其中Petrifilm RSA 檢出陽性結果為42只,占全部陽性檢樣的93.3%,Baird-Parker+RPF Agar. 檢出陽性結果26只,占全部陽性檢樣的57.7%。Baird-Parker. Agar 檢出陽性結果32只,占全部陽性檢樣的71.1%。

討論
1. 用15株標準菌在3種培養基中的檢測,10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種,結果生長良好,其最終計數基本一致,定位在同一數量級,5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養基全部不長,說明上述三種培養基對金黃色葡萄球菌選擇良好。
2. 以101只自然樣品同一均質稀釋液,同時接種三種培養基,從最終結果來看,對金黃色葡萄球菌的陽性檢出率為44.5%
3. 從檢測程序來年,Petrifilm. RSA及Baird-Parker+RPF. Agar. 都在樣品接種后28~30h觀察結果,并不必再做證實試驗,而如以Baird-Parker Agar檢測,須在接種后48h觀察平板,并挑取可疑菌落轉種到營養肉湯中,在經18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗進行證實,最終計數,前后約須80h。
4. 從本次試驗中觀察,使用上述三種培養基對食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計數檢測,其樣品接種液的含量擬控制在100個/ml以內,比較容易分清并計數,如菌量過濃,則將會影響最后的讀數,因此對新送的被檢樣品,如在不了解污染的情況下一般必須要做2個以上的稀釋度,同時分別接種,才能獲得較為滿意的結果。
而在Baird-Parker+RPF Agar及Baird-Parker. Agar接種時必須將1ml樣液作三只平板涂布(0.3、0.3、0.4ml)這樣就會造成手續繁瑣試劑消耗較大,但Baird-Parker. RPF. 培養基也可以1ml樣液作傾注培養,并作計數。
5. 在整個測試過程中,我們發現,按使用說明對Petrifilm. RSA. 及Barid-Parker+RPF. Agar,操作規定在接種24h后觀察結果,此時往往由于菌落長得經較小,特征瓜不明顯,但如果繼續放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯,并可能會經第一天觀察數量有所增加,這樣可以提高檢測結果的可信度。
6. 由于對上述兩種培養基的試用期間我們尚未獲得供應商的報價,故無法測算每一樣品的測試成本價格。但可以予計上述兩面種快速檢測培養基的耗材費用要高于常規經典方法(Baird-Parker Agar)的費用。
7. 通過本次實驗,我們感到使用美國3M公司生產的Petrifilm. RSA Plate培養基和法國生物-梅利埃公司生產的Baird-Parker RPF. Agar培養基檢測中的金黃色葡萄球菌。可以比目前常規檢測方法時間可縮短一半。并可以明顯節省大量人力。這完全符合實驗室快速檢測的要求,尤其是對基層較簡陋的實驗室條件中,更顯其使用方便的優越性。

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